Direttiva 2000/45

Determinazione comunitaria di vitamina A, vitamina E e triptofano nei mangimi

La direttiva 2000/45/CE della Commissione fissa metodi di analisi comunitari da utilizzare nei controlli ufficiali sugli alimenti per animali e sulle premiscele. La finalità è assicurare uniformità e comparabilità dei controlli relativi a sostanze che, in base ad altri atti dell’Unione richiamati nei considerando, devono essere dichiarate o indicate in etichetta.

Obiettivi e base normativa

La direttiva si fonda sulla direttiva 70/373/CEE, che richiede che i controlli ufficiali sugli alimenti per animali siano effettuati con metodi comunitari di campionamento e di analisi. I considerando richiamano inoltre:

• la direttiva 70/524/CEE sugli additivi nell’alimentazione animale, che impone l’indicazione in etichetta del contenuto di vitamina A e vitamina E quando tali sostanze sono aggiunte a premiscele e alimenti per animali;
• la direttiva 79/373/CEE sugli alimenti composti per animali e la direttiva 93/74/CEE sugli alimenti per animali destinati a particolari fini nutrizionali, che prevedono la dichiarazione degli amminoacidi in etichetta.

La Commissione evidenzia quindi la necessità di disporre metodi analitici comunitari per il controllo di tali sostanze.

Obblighi per gli Stati membri

L’articolo 1 impone agli Stati membri di prescrivere che le analisi per i controlli ufficiali di alimenti per animali e premiscele, per quanto riguarda vitamina A, vitamina E e triptofano, siano eseguite con i metodi riportati nell’allegato.

Il contenuto dell’obbligo è di risultato: gli Stati membri devono assicurare l’uso di quei metodi nei controlli ufficiali, ma conservano margini di discrezionalità sulla forma e sui mezzi di recepimento.

Recepimento, decorrenza e riferimento all’atto

L’articolo 2 stabilisce:

• termine di recepimento: non oltre il 31 agosto 2000;
• applicazione delle misure: dal 1° settembre 2000;
• obbligo di informare immediatamente la Commissione;
• obbligo di inserire un riferimento alla direttiva negli atti nazionali di recepimento oppure di corredare tali atti di un riferimento all’atto al momento della pubblicazione ufficiale.

Le modalità del riferimento sono lasciate agli Stati membri.

Entrata in vigore e destinatari

L’articolo 3 prevede l’entrata in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. L’articolo 4 indica come destinatari gli Stati membri.

Allegato: struttura dei metodi analitici

L’allegato è articolato in tre parti, ciascuna dedicata a una sostanza o classe di sostanze, e contiene anche le indicazioni operative di laboratorio, i criteri di ripetibilità e i richiami a studi collaborativi.

Parte A: vitamina A

Il metodo riguarda la determinazione della vitamina A (retinolo) negli alimenti per animali e nelle premiscele. La vitamina A comprende l’alcole retinilico tutto trans e i suoi isomeri cis, che vengono determinati con lo stesso metodo. Il contenuto è espresso in unità internazionali per kg; una UI corrisponde a specifiche quantità di alcole, acetato o palmitato di vitamina A tutto trans.

Il limite di determinazione è pari a 2000 UI/kg.

Il principio operativo prevede:

• idrolisi/saponificazione con soluzione etanolica di idrossido di potassio;
• estrazione con etere di petrolio;
• evaporazione del solvente e ridissoluzione in metanolo;
• determinazione mediante RP-HPLC con rivelatore UV o a fluorescenza.

Il testo specifica numerosi reagenti e apparecchiature, tra cui colonna C18, solventi, standard certificati, BHT, vetri ambrati, evaporatore rotante e dispositivo di estrazione dedicato. Le operazioni devono essere eseguite al riparo da luce e ossigeno, poiché la vitamina A è sensibile a ossidazione e UV.

La procedura comprende:

• preparazione del campione con triturazione a 1 mm;
• saponificazione con etanolo, BHT, ascorbato di sodio, solfuro di sodio e KOH;
• estrazione con etere di petrolio, lavaggi con acqua e rimozione di acqua residua;
• preparazione della soluzione per HPLC con concentrazione finale di vitamina A nell’intervallo 5–30 UI/ml;
• analisi HPLC su colonna C18 con rivelazione a 325 nm o fluorescenza;
• taratura mediante soluzioni standard e standardizzazione UV delle soluzioni madre.

Il calcolo del contenuto del campione avviene per confronto con la curva di taratura; la formula richiama la concentrazione della soluzione campione, il volume della soluzione, l’aliquota analizzata e la massa del campione.

Le osservazioni prevedono, tra l’altro, l’eventuale combinazione di estratti per campioni poveri di vitamina A, la limitazione del contenuto di grassi del campione analizzato a non più di 2 g, la possibilità di usare idrochinone al posto del BHT e di utilizzare acido ascorbico o EDTA in sostituzione dei reattivi antiossidanti/chelanti previsti.

La ripetibilità richiede che la differenza tra due determinazioni parallele non superi il 15 % del risultato più elevato.

Parte B: vitamina E

Il metodo riguarda la determinazione della vitamina E negli alimenti per animali e nelle premiscele. Il contenuto è espresso in mg di acetato di DL-α-tocoferolo per kg; 1 mg di acetato di DL-α-tocoferolo corrisponde a 0,91 mg di DL-α-tocoferolo.

Il limite di determinazione è pari a 2 mg/kg.

Il principio è sostanzialmente analogo a quello della vitamina A: saponificazione con KOH etanolico, estrazione in etere di petrolio, evaporazione, ridissoluzione in metanolo e determinazione RP-HPLC con rivelatore UV o a fluorescenza. La rivelazione indicata è a fluorescenza con eccitazione a 295 nm ed emissione a 330 nm, oppure UV a 292 nm.

La parte B dettaglia:

• reagenti e soluzioni standard di acetato di DL-α-tocoferolo e DL-α-tocoferolo;
• attrezzature identiche in larga parte a quelle della parte A;
• preparazione del campione, saponificazione ed estrazione;
• preparazione della soluzione campione con concentrazione di DL-α-tocoferolo nell’intervallo 5–30 μg/ml;
• taratura con due possibili standard e verifica UV delle soluzioni di riserva;
• calcolo del contenuto del campione in mg/kg come acetato di α-tocoferolo.

Le osservazioni richiamano, tra l’altro, la possibilità di combinare estratti per campioni a basso tenore, il limite di grassi del campione a 2 g, l’uso alternativo di idrochinone, acido ascorbico o EDTA, e la conservazione in frigorifero delle soluzioni standard dopo aggiunta di BHT, per un massimo di 4 settimane.

Anche per la vitamina E la ripetibilità massima consentita è del 15 %.

Parte C: triptofano

Il metodo riguarda il triptofano totale e libero negli alimenti per animali; non distingue tra forme D e L.

Per il triptofano totale, il campione è idrolizzato in condizioni alcaline con idrossido di bario saturo e riscaldato a 110 °C per 20 ore; lo standard interno è aggiunto dopo l’idrolisi. Per il triptofano libero, il campione è estratto in condizioni moderatamente acide in presenza dello standard interno.

La determinazione analitica avviene mediante HPLC con rivelatore a fluorescenza. Sono previsti:

• acqua bidistillata o equivalente;
• standard di triptofano e standard interno α-metil-triptofano;
• soluzioni acide e basiche a concentrazioni definite;
• fase mobile con acido acetico, acqua, 1,1,1-tricloro-2-metil-2-propanolo e etanolammina, a pH 5,00.

La preparazione del campione richiede triturazione a 0,5 mm; i campioni molto umidi devono essere essiccati o liofilizzati, mentre quelli ad alto tenore di grassi devono essere preventivamente sgrassati con etere di petrolio.

La procedura distingue due percorsi:

• determinazione del triptofano libero, con estrazione in HCl 0,1 mol/l, aggiunta di standard interno, regolazione del pH a 3 e preparazione della soluzione per HPLC;
• determinazione del triptofano totale, con pesata di 0,1–1 g, aggiunta di Ba(OH)2 e acqua, idrolisi in autoclave a 110 °C per 20 ore, successiva neutralizzazione, aggiunta di standard interno e preparazione per la cromatografia.

Il calcolo del risultato utilizza il rapporto tra aree di picco del triptofano e dello standard interno, con formule che incorporano concentrazioni e volumi delle soluzioni di taratura e il peso del campione.

La ripetibilità è più stringente rispetto alle vitamine: la differenza tra due determinazioni parallele non deve superare il 10 % del valore più elevato.

Considerazioni pratiche per operatori e laboratori

Per avvocati e commercialisti che assistono operatori del settore mangimistico o laboratori ufficiali, il dato centrale è che la direttiva non disciplina il contenuto sostanziale delle etichette, ma uniforma il metodo di verifica ufficiale. Il recepimento nazionale deve essere tempestivo e i laboratori devono adeguare le procedure analitiche alle specifiche dell’allegato, in particolare per preparazione dei campioni, conservazione, standardizzazione e criteri di ripetibilità.

La direttiva lascia un margine tecnico agli Stati membri e ai laboratori quanto a strumentazione e condizioni cromatografiche, purché siano ottenuti risultati equivalenti e siano rispettati i parametri minimi fissati nei metodi.