Direttiva 2006/56

Direttiva 2006/56/CE della Commissione: aggiornamento tecnico della disciplina sul marciume anulare della patata

La direttiva interviene sulla direttiva 93/85/CEE, che disciplina la lotta contro il marciume anulare della patata causato da Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Alla luce delle nuove conoscenze scientifiche e dell’esperienza pratica, la Commissione aggiorna integralmente gli allegati tecnici, rafforzando gli strumenti di diagnosi, conferma e contenimento dell’organismo nocivo.

Finalità e contesto normativo

L’obiettivo dichiarato è migliorare la capacità degli Stati membri di localizzare l’organismo nocivo, determinarne la diffusione, prevenirne l’insorgenza e la propagazione e, se individuato, impedirne la diffusione e combatterlo ai fini dell’eradicazione. I considerando evidenziano che il patogeno è ancora presente in alcune zone della Comunità e che le procedure di rilevamento e identificazione sono state sviluppate, in particolare con tecniche come FISH e PCR.

Ambito di applicazione

La disciplina riguarda:

• i tuberi di patata e le piante di patata, sintomatici e asintomatici;
• i laboratori e i protocolli ufficiali di diagnosi;
• le misure di contenimento, notifica e sorveglianza nei luoghi di produzione;
• il trattamento, l’uso o lo smaltimento dei prodotti e rifiuti contaminati o potenzialmente contaminati;
• i controlli ufficiali sulle imprese che coltivano, immagazzinano, manipolano o trasportano patate.

Recepimento, decorrenza e vincoli per gli Stati membri

L’articolo 2 stabilisce un obbligo di recepimento entro il 31 marzo 2007, con applicazione dal 1 aprile 2007. Gli Stati membri devono anche comunicare alla Commissione il testo delle misure di recepimento e una tabella di correlazione. La direttiva entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale e vincola gli Stati membri quanto al risultato da raggiungere, lasciando loro la scelta della forma e dei mezzi.

Schema diagnostico: principi generali

L’allegato I sostituisce lo schema diagnostico precedente e disciplina l’intera sequenza di analisi per il rilevamento e l’identificazione dell’organismo nocivo. I protocolli devono essere eseguiti in condizioni di quarantena adeguate, con autorizzazioni ufficiali, corretta gestione dei rifiuti, strumenti tarati e misure stringenti contro la contaminazione incrociata.

La direttiva insiste su alcuni principi generali:

• i saggi devono garantire rilevamenti certi e riproducibili alle soglie previste;
• i controlli positivi devono essere preparati con particolare accuratezza;
• i campioni e i controlli positivi devono essere tenuti separati;
• devono essere applicate norme di controllo qualità, soprattutto per etichettatura e documentazione.

Campionamento e preparazione dei campioni

Per i tuberi il campione standard è di 200 tuberi; per le piante asintomatiche è raccomandato un campione composito fino a 200 segmenti di fusto. I campioni vanno trattati mediante estrazione e concentrazione del patogeno, con possibilità di refrigerazione o conservazione con glicerolo per ulteriori saggi. La direttiva descrive in dettaglio le modalità di lavaggio, asportazione dei coni ombelicali, conservazione, omogeneizzazione, chiarificazione e centrifugazione.

Per le piante di patata si prelevano segmenti di fusto basali disinfettati, che possono essere trattati con agitazione o macerazione. L’estratto può essere ulteriormente chiarificato o concentrato, se necessario.

Saggi di selezione preliminare: IF, FISH e PCR

La direttiva prevede tre principali saggi di selezione preliminare:

• colorazione di immunofluorescenza (IF);
• saggio FISH;
• saggio PCR.

Per ciascun metodo sono definiti i criteri tecnici, i controlli positivi e negativi, le soglie di sensibilità e le modalità di interpretazione. In generale, un risultato positivo in un primo saggio deve essere confermato da un secondo saggio basato su principio biologico diverso; se il secondo saggio è negativo, il campione è considerato negativo. Quando invece due saggi preliminari risultano positivi, si procede all’isolamento e alla conferma.

Colorazione di immunofluorescenza (IF)

Il saggio IF è raccomandato come principale metodo di selezione preliminare. La direttiva richiede l’uso di anticorpi convalidati, preferibilmente policlonali, e definisce titolo, diluizioni di lavoro, modalità di preparazione del vetrino, incubazione, lavaggio e lettura al microscopio a epifluorescenza.

La lettura è positiva quando si osservano cellule fluorescenti brillanti con morfologia tipica e in numero almeno pari a 5 × 10^3 cellule tipiche per ml di sedimento centrifugato risospeso. Al di sotto di tale soglia il campione è considerato negativo.

Saggio FISH

Il saggio FISH utilizza oligosonde specifiche convalidate per il patogeno e una sonda eubatterica come controllo del processo di ibridizzazione. Sono disciplinate fissazione, preibridazione, ibridazione, lavaggi e lettura con microscopio a epifluorescenza.

Anche qui il risultato è positivo se si osservano cellule tipiche brillanti e, ai fini della valutazione quantitativa, la soglia di 5 × 10^3 cellule per ml di sedimento risospeso determina la qualificazione del campione come potenzialmente contaminato. Il testo segnala possibili problemi di specificità dovuti a cellule fluorescenti atipiche o batteri saprofiti con reazione crociata.

Saggio PCR

Il saggio PCR richiede protocolli e reagenti convalidati e dovrebbe essere usato come metodo principale solo da tecnici esperti. La direttiva include controlli negativi e positivi, istruzioni per la purificazione del DNA e un protocollo multiplex con controllo interno.

L’interpretazione è positiva quando compare l’amplicone specifico per C. m. subsp. sepedonicus delle dimensioni previste, eventualmente accompagnato dal modello di restrizione caratteristico. È prevista anche la verifica dell’autenticità dell’amplicone mediante digestione con Bgl II. Il testo segnala il rischio di inibizione della PCR e di contaminazione del DNA bersaglio.

Saggio biologico su melanzana

Il saggio biologico serve a confermare la presenza del patogeno e a rilevarne infezioni latenti. Si inoculano melanzane in specifiche condizioni di quarantena, con controllo positivo e negativo separati e rigorose precauzioni contro la contaminazione incrociata. Le piante devono essere esaminate periodicamente per la comparsa di sintomi e, se necessario, il patogeno va reisolato e identificato.

Se dopo 4 settimane non si osservano sintomi, la direttiva impone comunque un saggio IF/PCR su sezioni di fusto delle piante inoculate; in caso di positività si procede al reisolamento. Il saggio è considerato valido solo se i controlli positivi mostrano i sintomi attesi e i controlli negativi restano sani.

Isolamento, identificazione e prova di patogenicità

La diagnosi completa richiede l’isolamento del patogeno, la sua identificazione e la conferma mediante prova di patogenicità. L’isolamento avviene su terreni selettivi e non selettivi, in particolare MTNA o NCP-88, con controlli di crescita e letture a intervalli definiti.

L’identificazione delle colture pure può essere effettuata con almeno due saggi basati su principi biologici diversi, tra cui:

• saggi nutrizionali ed enzimatici;
• IF;
• PCR;
• FISH;
• profilo degli acidi grassi (FAP);
• BOX-PCR.

La prova di patogenicità su melanzana costituisce la conferma finale della diagnosi e serve anche a valutare la virulenza dell’isolato.

Conservazione dei campioni e documentazione

L’allegato II impone, nei casi sospetti, la conservazione di tutti i tuberi e, ove possibile, di tutti i campioni di piante, oltre agli estratti residui, ai materiali supplementari e alla documentazione pertinente fino alla conclusione delle prove. In caso di conferma, il materiale va mantenuto per almeno un mese dalla notifica, insieme alla coltura isolata e al materiale di melanzana infetto inoculato.

Contaminazione probabile, disseminazione e notifica

L’allegato III elenca i criteri per identificare:

• l’entità della contaminazione probabile;
• la potenziale disseminazione del patogeno.

La notifica deve contenere, al minimo, dati sulla varietà del lotto, il tipo di patate e la categoria, i riferimenti dell’esportatore e del destinatario, la data di consegna, le dimensioni del lotto e gli estremi del passaporto delle piante o equivalenti. A chiusura delle indagini vanno inoltre indicati la data di conferma, il percorso dell’indagine, le fonti presunte o identificate, l’estensione della contaminazione e altri elementi eventualmente richiesti dalla Commissione.

Misure ufficiali nei luoghi contaminati e nella zona delimitata

L’allegato IV disciplina le misure da applicare a prodotti, oggetti, magazzini e aree contaminate o probabilmente contaminate. Le autorità competenti possono autorizzare:

• uso come patate da consumo con trattamento o confezionamento idoneo;
• smaltimento in siti approvati;
• incenerimento;
• trasformazione industriale con strutture autorizzate;
• altri impieghi solo se è escluso ogni rischio di disseminazione.

Nei luoghi di produzione contaminati e nella zona delimitata sono previsti, a seconda dei casi, divieti di coltivazione, rotazioni obbligatorie, maggese o pascolo, pulizia e disinfezione di macchinari e magazzini, controlli ufficiali sui tuberi raccolti e uso esclusivo di tuberi-seme certificati o ufficialmente controllati per diversi anni vegetativi.

Smaltimento dei rifiuti

L’allegato V stabilisce che i rifiuti solidi di patata, inclusi terra e detriti associati, devono essere smaltiti in siti approvati, inceneriti o eliminati con altri metodi autorizzati senza rischio di disseminazione. I rifiuti liquidi devono essere prima filtrati o decantati se contengono materiale solido; poi possono essere riscaldati almeno a 60 °C per 30 minuti oppure eliminati con altri metodi ufficialmente approvati. Le medesime regole valgono per i rifiuti associati alla manipolazione, allo smaltimento e alla lavorazione dei lotti contaminati.